PCR检测方法之争——实时荧光PCR(qPCR)与环介导等温扩增技术（LAMP)

在分子检测当中，qPCR与LAMP是两个比较热门的方法。两个技术各有拥护者，大家都觉得各自的技术是更加先进的。相信很多人都接触或者听说过这两个技术，但二者之间的差别在哪里，孰优孰劣？很多人或许就没有深入了解了。今天，我们在这里就对两个技术做一个比较。

要了解这两个技术的差别，首先我们要了解这两个方法的原理。

上面是PCR扩增过程的一个简图，PCR扩增分为三个过程。第一，变性，通过温度的升高，通常为94摄氏度左右，让模板DNA双链解链为单链，为接下来引物的结合提供条件；第二，退火，通过降低温度，通常为55摄氏度左右，让引物与单链DNA特异性结合，以便Taq酶进行碱基延伸；第三，延伸，再次升高温度，通常为70-75摄氏度，Taq酶以结合到单链DNA上的引物的3’端为起点，以DNA链为模板进行延伸。然后又回到第一步变性，如此循环，目标基因片段就会得到指数倍的扩增，经过40个循环，目标基因片段可以获得百万倍的扩增。

在qPCR中，会在反应体系中加入荧光探针或者荧光染料，探针或者染料结合到合成的DNA链上，引发荧光反应，DNA合成越多，荧光的强度也就越大，通过光度计探测荧光的数值，也就可以换算出合成DNA的量，接着计算出DNA模板的起始量。这就qPCR原理的简单描述。

接下来我们再看看LAMP法的原理。

LAMP法的关键是在引物的设计上。相比较普通PCR方法，LAMP法需要设计两对引物FIP和BIP，F3和B3。这两对引物与模板DNA在具有链置换活性的BstDNA聚合酶于60-65摄氏度恒温环境下，产生带环状结构的产物，接着引物又与环状中的单链部位结合，继续产生带环状的产物，如此引发目的基因的高效扩增。

LAMP法最具特色的地方是由引物的巧妙设计，不断产生带环状结构产物，然后引物以环状中的单链位置为结合位点，在双链没有解链的情况下不断发生新链的合成。

由于二者的扩增过程的不同，导致二者表现出来的特点也不一样。

 1  需要的仪器设备不同。因为LAMP法是在恒温条件下进行扩展，所以LAMP法所需要的设备只需要一个能产生恒定温度即可，对于仪器的要求比较低，而qPCR需要在变性、退火、延申三个不同温度下不断切换，所以需要一个能快速产生温度变化的设备，这对设备的要求会比较高，因为如果仪器变温速度不够快，会导致非特性扩增，影响结果的准确性。所以早期的qPCR设备都很昂贵，动辄几十万，不过现在很多设备的价格都已经降了下来，像方舟生物的qPCR仪价格就是很实惠的了。

 2  操作过程不同。两个方法大同小异，基本过程都如下图所示。

DNA的提取过程都差不多，不同点主要在中间的扩增过程和后续的判读上。因为各自扩增的特点，扩增的过程、时间和产生的产物都不一样。LAMP法是在恒温条件下进行的，所以只要设定一个温度即可进行工作，qPCR则需要设定三个不同的温度进行循环。LAMP法一般在15-60分钟内完成，可产生10^9-10^10倍的产物，qPCR一般进行40个循环，所需时间在60分钟内，可产生百万倍的扩增产物。也就是说LAMP的扩增效率更高。

 3  结果判读方式不同。qPCR通常是采用实时荧光检测进行结果判读，而LAMP则有多种方式，浊度法，荧光法，电泳法等。但是因为LAMP的特点，他的结果是没有特异性的，也即是说他只是判断是否发生扩增，而不能对非特异性扩增进行判断，这也导致LAMP假阳性的结果比较多，且只能进行定性而不能进行定量检测，影响LAMP大规模推广。而qPCR可通过荧光探针的方法进行结果判读，具有特异性和定量的特点。

 4  结果准确性。LAMP方法有两对引物，因此其扩增的特异性比较高，但是由于其灵敏性很高（产物可达10^10倍），所以也导致LAMP的实验环境要求很高，因为少量的污染也可能导致假阳性的产生，另外LAMP的引物浓度比较高，有时会发生引物间的配对，引发扩增，导致假阳性，这些都是影响LAMP推广的因素。相对应的，qPCR的结果是比较可靠的。

 5  检测通量。由于结果判读的方式不同，LAMP一个实验只能进行一个目的基因的检测，而qPCR可通过引物与探针的设计，进行多通道检测，从未实现一个实验检测多个目的基因。

 6  另外，LAMP对于长链目前基因的扩增效率比较慢，所以LAMP只能进行短链扩增，这也影响了LAMP的应用场景。

综上所述，LAMP与qPCR各有优劣，但在目前对检测结果高准确型，高通量等要求下，qPCR的应用还是更加广一些。